用1个标志物检测所有肿瘤？全癌标志物或将带来普通人用得起的癌症早筛丨专访复旦大学于文强

（来源： Clinical and Translational Medicine ）

此前，该团队于 2019 年在 Cancer Research 上发表了其发现的 第一个全癌标志物 HIST1H4F。

（来源：Cancer Research）

“但其实，全世界都在说每种肿瘤基本上都不一样，都在做精准医学（个性化医学）的时候，我们说发现了全癌标志物这样一个所有肿瘤的共同特征，绝大部分人是很难理解和接受的。”

于文强也提到，“不过现在很多人在做泛癌标志物，说明大家还是希望能够有一种方法来诊断多种癌症，只不过我们具体采用的策略不同 —— 泛癌标志物筛查本质上是用多种标志物诊断多种肿瘤，就是把多种单一癌症标志物放到一个大 panel 里，通过这个 panel内所有基因的检测去判断是否存在癌症，是 ‘多对多’的关系。而全癌标志物是在目前研究的所有肿瘤中都存在的甲基化位点，全癌标志物检测就是用这样的一个或两个标志物诊断多种癌症，是‘一对多’的关系。全癌标志物和泛癌标志物的目标都是一样的。”

另外，于文强表示，“全癌标志物和泛癌标志物的检测方法也是不同的，目前泛癌标志物只能通过二代测序检测，相比之下，只有一个或两个位点的全癌标志物可以用 qPCR 等简单的方法检测。”

一个标志物，“识别” 17 种癌症

随着 DNA 甲基化的研究发展，DNA 甲基化检测已可用于多种肿瘤的早期筛查、辅助诊断、疗效判定以及预后监测等，通常不同的肿瘤可分别通过不同的标志物检测出来。

目前，DNA 甲基化检测主要通过焦磷酸测序或高通量测序（NGS）进行，若想获得人体全基因组范围内单碱基分辨率的所有 DNA 甲基化情况，则通常需要借助全基因组 DNA 甲基化测序技术（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）实现，只是这些方法的成本高昂，很难为寻常百姓所用。

正如业内流传的那般，于文强也提到 “做 DNA 甲基化检测是有钱人的游戏”，他进一步说，这一方面是因为需要检测的位点很多，另一方面也是由测序的方式造成的。“当时（2010 年左右）二代测序的比对率不到 30%，造成数据浪费的同时，也是对人力和财力的极大消耗。”

面对这一现状，于文强团队自主开发了新型测序技术（GPS），并通过这项技术发现了全癌标志物，目前已公开报告的有前文提到的 HIST1H4F 和 PCDHGB7。

关于全癌标志物 HIST1H4F 的报告论文中显示，他们首先在肺癌中发现多个组蛋白基因异常的高甲基化状态。进一步验证中，他们在分析肿瘤基因组图谱 (TCGA) 数据库 17 种肿瘤（肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、宫颈癌等）的 7000 多例样本分析中发现，某些组蛋白基因在多种癌症中均存在甲基化异常现象，尤其是 HIST1H4F 基因。

图｜17 种肿瘤中 85 种组蛋白基因的甲基化状态 (A)、HIST1H4F 在 17 种肿瘤中的甲基化状态（B）（来源：论文）

为进一步验证这一现象，于文强团队在 8 种肿瘤临床样本中进行检测，他们发现，在这 8 种肿瘤样本中，HIST1H4F 均存在高甲基化现象。由此，于文强提出， HIST1H4F 是潜在的肿瘤共有标志物，"全癌标志物" 也是从这是开始提出的。“当用一个位点就能检测出癌症，成本自然很低，甚至比现在的新冠检测（2 个位点）更低。”

图｜HIST1H4F 基因在 8 种肿瘤临床样本中的甲基化状态（来源：论文）

先有 GPS，再有全癌标志物

这里的 GPS 是 Guide Positioning Sequencing 的缩写，含义也很直白，即 “导航定位测序”，正是前文提到的于文强团队历时 8 年开发的全基因组 DNA 甲基化检测新方法。如 Global Positioning System 一般，GPS（Guide Positioning Sequencing）也具有定位功能，不同之处在于，GPS 用于 DNA 甲基化的定位。全癌标志物的发现，也正是在 GPS 的基础上实现的。

开发 GPS 的故事，要从于文强对线粒体 DNA 甲基化的兴趣说起。

2009 年底，在瑞典乌普萨拉大学 Rolf Ohlsson 教授实验室和约翰霍普金斯大学医学院从事近 10 年 DNA 甲基化研究工作后，于文强回到中国，并选择一条与出国前不尽相同的医学道路 —— 从临床医生到专注科研。

归国后，于文强来到复旦大学并牵头表观遗传学领域中国第三个 973 项目，进行 DNA 甲基化研究。“有一天，我在寻找线粒体 DNA 的甲基化信息，但竟然没有任何信息可用。当时我们已经进入二代测序时代，如果连仅有 16kb 的线粒体 DNA 都没有甲基化信息，那不能说线粒体 DNA 甲基化不重要，而是说明全基因组 DNA 甲基化检测一定存在什么问题 —— 序列比对率低、比对准确性差。” 这也正是 DNA 甲基化检测普及的障碍：价格高，但靠谱度低。

“出现这两大问题是由于测序策略上出现了偏差，” 于文强说，“其实现在的 DNA 甲基化检测用的是一个非常绕的方法，先用 Bisulfite 处理 DNA 序列，把基因组中未发生甲基化的 C 碱基转换成 T，以与原本具有甲基化修饰的 C 碱基进行区分，但是这样一来，原本人体基因组序列中的 4 个碱基就变成了 3 个，导致很多序列即使测到了也无法实现准确比对。”

面对这一问题，他们决定尝试优化双端测序的方案，即一端是在 Bisulfite 处理后仍保持基因组原序列，另一端则是转化后的表观检测序列。

具体实现上，“我们想到 T4 DNA 聚合酶，在反应体系中没有 dNTP 的情况下，可以发挥 3'-5' 外切酶的活性，当反应体系中存在 dNTP 时可以发挥 5'-3' 聚合酶的活性，不过在反应体系中，我们将 dNTP 中的胞嘧啶换成甲基化的胞嘧啶就可以了。这样一来，所有的 DNA 片段 3' 端在亚硫酸盐处理后还保持基因组序列，可用来定位；5' 端可以用来计算甲基化。"

这种方法就是前文提到的新型测序技术 GPS（Guide Positioning Sequencing），于文强表示，目前该技术已经获得国内和国际专利。

图 | GPS（Guide Positioning Sequencing）工作原理（来源：相关论文）

从 “别人根本不相信”，到已完成近 2 万例样本筛查

于文强与表观遗传学于 2001 年结缘，而他对医学知识的系统学习早在 1983 年开始。

从 1983 年踏入第四军医大学、在四医大西京医院 12 年临床医生到如今走在医学科研最前沿，从 2001 年进入表观遗传学领域到发现或可适用于全部癌症的 DNA 甲基化标志物，于文强以 “我的经历背景比较简单” 这样平淡的一句话概括他深耕 30 多年的医学之路。

但每每，说到全癌标志物的时候，他便滔滔不绝。“我认为，全癌标志物的发现意义非常非常重大，这可能会改变我们对肿瘤的很多理解。”

只是，就如前文所说，目前全癌标志物的接受度并不是很高。于文强坦言，“很多人根本不相信。没关系，如果相信我们可以一起做研究，如果不相信，那也不要紧，时间会证明一切。”

于文强表示，“我觉得做研究、做实验有一个事情非常重要，就是思维永远不能固化。世界上所有理论、定理、甚至真理都只是我们的‘铺路石’，不能以此来束缚自己前进的方向，如果只是在那些固定框架里去做研究，那永远也跳不出这些框框。”

在全癌标志物备受争议的大环境下，目前国内仅有上海奕谱生物基于这一方法进行肿瘤的检测，力图推动全癌标志物在肿瘤筛查中的应用。

而“别人不相信”也为奕谱生物推动全癌标志物带来便利，“今年 3 月份出台的 LDT（Laboratory developed test, 临床实验室自建项目）合法化政策对全癌标志物的验证是一个很好的机遇，这比拿到证才能开始大规模临床试验有了先天的优势，因为只有这一家在做。”

LDT 合法化：

2021 年 3 月 18 日，国家药监局网站发布修订后的《医疗器械监督管理条例》明确，“对国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需要，可以自行研制，在执业医师指导下在本单位内使用。”

“基于 GPS 技术发现的全癌标志物检测已与国内多家医院展开合作，并在山东菏泽开展为期 3 年的两癌筛查公益项目，计划今年完成 1 万例样本检测，目前已经完成约 6000 例。我们希望通过这次大规模检测先把菏泽地区的宫颈癌发病率降下来”，于文强表示，目前全癌标志物最多的应用是开展对宫颈癌的早期筛查，其次是膀胱癌的术后复查。

最后，他提到，在全癌标志物以及肿瘤方面，接下来他将继续探索全癌标志物在肿瘤中发生 DNA 甲基化的深层次机制，由此寻找肿瘤共同的治疗方案。

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